熒光分光光度計定量分析時(shí)多采用工作曲線(xiàn)法，即以已知量的標準物質(zhì)，按試樣相同方法處理后，配成一系列標準溶液，測定其相對熒光強度和空白溶液的相對熒光強度，扣除空白值后，以熒光強度為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，繪制工作曲線(xiàn)。
然后將處理后的試樣配成一定濃度的溶液，在同一條件下測定其相對熒光強度，扣除空白值后，從工作曲線(xiàn)上求出熒光物質(zhì)的含量。
在熒光分光光度計用熒光分析法測定某些會(huì )引起熒光改變的微量物質(zhì)時(shí)，常采用差示熒光法，可使熒光強度的讀數差距拉大，使熒光強度的降低加大，從而提高方法的靈敏度和準確度。
在使用時(shí)需要注意開(kāi)機次序，光度計開(kāi)機順序一般為先開(kāi)氙燈，然后開(kāi)儀器主機，接著(zhù)開(kāi)跟儀器連接的計算機。如此操作的原因在于穩態(tài)氙燈是高壓點(diǎn)亮，為了避免瞬問(wèn)脈沖電流對周?chē)O備造成影響，需要先開(kāi)氙燈，等電流穩定后再打開(kāi)周邊的電腦等設備。關(guān)機順序則相反。
熒光分光光度計使用注意事項：
1、樣品應盛在四面透光的石英比色皿（熒光池）中，如果是揮發(fā)性樣品應使用帶塞的熒光池。
2、在使用儀器進(jìn)行熒光分析時(shí)，為了得到穩定可靠的數據，一般需要開(kāi)機預熱氙燈大約30分鐘。如果儀器光源采用的是閃爍氙燈，預熱時(shí)間可以縮短到10分鐘左右。對某些易感光、易分解的熒光物質(zhì)，盡量采用長(cháng)波長(cháng)、低人射光強度及短時(shí)間光照。
3、溫度變化可引起儀器熒光強度的改變。通常降低溫度，有利于提高熒光量子產(chǎn)率，熒光強度增大。溫度影響熒光強度的明顯程度因樣品而異，大部分熒光物質(zhì)的熒光強度受溫度影響不大，測試溫度變化不超過(guò)±3℃，對測試結果幾乎無(wú)影響。
4、當儀器的熒光物質(zhì)是弱酸或弱堿時(shí)，溶液的pH對熒光強度有較大影響。因為弱酸或弱堿在不同酸度中，分子和離子的電離平衡會(huì )發(fā)生改變，而熒光物質(zhì)的熒光強度會(huì )因其離解狀態(tài)發(fā)生改變。
5、熒光分光光度計的熒光物質(zhì)分子與溶液中其它物質(zhì)分子之間作用導致熒光強度降低，常見(jiàn)的熒光猝滅劑，如鹵素離子、重金屬離子、02、硝基化物質(zhì)、重氮化合物等。
溶液中的溶解氧也能引起幾乎所有的熒光物質(zhì)產(chǎn)生不同程度的熒光熄滅現象，因此在較嚴格的熒光實(shí)驗中必須除氧。
